Детектори. Реєстрація виходу з колонки окремого компонента проводиться за допомогою детектора. Для реєстрації можна використовувати зміна будь-якого аналітичного сигналу, що йде від рухомої фази і пов'язаного з природою та кількістю компонента суміші. У рідинної хроматографії використовують такі аналітичні сигнали, як светопоглощение або светоіспусканіе виходить розчину (фотометричні та флуоріметріческіе детектори), показник заломлення (рефрактометрическим детектори), потенціал і електрична провідність (електрохімічні детектори) та ін 
Безперервно Детектируемая сигнал реєструється самописцем. Хроматограмма являє собою зафіксовану на стрічці самописця послідовність сигналів детектора, що виробляються при виході з колонки окремих компонентів суміші. У разі поділу суміші на зовнішній хроматограмі видно окремі піки. Положення піка на хроматограмі використовують для цілей ідентифікації речовини, висоту або площа піка - для цілей кількісного визначення. 
Якісний аналіз 
Ріс.3.1.2. Параметри хроматограми 
Найважливіші характеристики хроматограми - час утримування t r і пов'язаний з нею утримуваний об'єм - відбивають природу речовин, їх здатність до сорбції на матеріалі нерухомої фази і, отже, при сталості умов хроматографування є засобом ідентифікації речовини. Для даної колонки з певними швидкістю потоку і температурою час утримування кожного з'єднання постійно (рис), де t R (a) - час утримування компонента А аналізованої суміші з моменту введення в колонку до появи на виході з колонки максимуму піку, t R (BC) - час утримування внутрішнього стандарту (спочатку відсутнє в аналізованій суміші речовина), h - висота піку (мм), a 1 / 2 - ширина піку на половині його висоти, мм. 
Для ідентифікації речовини за хроматограмі зазвичай використовують стандартні зразки або чисті речовини. Порівнюють час утримування невідомого компонента t Rx з часом утримування t RCT відомих речовин. Але більш надійна ідентифікація з вимірювання відносного часу утримування 
t R (A) 
t R (отн) = ____ (3.1.1). 
t R (BC) 
При цьому в колонку спочатку вводять відома речовина (внутрішній стандарт) і вимірюють час його утримування t R (BC), потім хроматографічно поділяють (хроматографіруют) досліджувану суміш, в яку заздалегідь додають внутрішній стандарт. Відносний час утримування визначають за формулою (3.1.1). 
Кількісний аналіз 
В основі цього аналізу лежить залежність висоти піку h або його площі S від кількості речовини. Для вузьких піків краще вимір h, для широких розмитих - S. Площа піку вимірюють різними способами: множенням висоти піка (h) на його ширину (а 1 / 2), виміряну на половині його висоти (рис 3.2.3); планіметрірованіем; за допомогою інтегратора. Електричними або електронними інтеграторами постачені сучасні хроматографи. 
Для визначення вмісту речовин у пробі використовують в основному три методи: метод абсолютної градуювання, метод внутрішньої нормалізації і метод внутрішнього стандарту. 
Метод абсолютної градуювання заснований на попередньому визначенні залежності між кількістю введеного речовини і площею або висотою піка на хроматограмі. У хроматограму вводять певну кількість градуювальної суміші і визначають площі або висота отриманих піків. Будують графік залежності площі або висоти піку від кількості введеної речовини. Аналізують досліджуваний зразок, вимірюють площу або висоту піка визначається компонента і на підставі градіровочного графіка розраховують його кількість. 
Метод внутрішньої нормалізації заснований на приведенні до 100% суми площ всіх піків на хроматограмі. Розрахунок масової частки в% одного компонента проводять за формулою 
K A S A 
w (a)% =________________, (3.1.2) 
K A S a + K b S b + ... K 2 S i 
де К - поправочні коефіцієнти, s a, s b, S i - площі піків компонентів суміші. 
Цей метод дає інформацію тільки про відносне змісті компонента в суміші, але не дозволяє визначити його абсолютну величину. 
Метод внутрішнього стандарту заснований на порівнянні обраного параметра піка аналізованого речовини з тим же параметром стандартного речовини, введеного в пробу у відомій кількості. У досліджувану пробу вводять певну кількість такого стандартного речовини, пік якого досить добре відділяється від піків компонентів досліджуваної суміші (рис. 3.2.3). Проводять аналіз проби з внутрішнім стандартом і розраховують кількість визначається речовини за формулою 
k (a) h (a) 
g (а) = ___________g (BC) (3.1.3) 
K (BC) h (BC) 
  
де g (A) - кількість визначається компонента А; h (A) - висота піку компонента A; g (BC) - кількість внутрішнього стандарту; h (BC) - висота піка внутрішнього стандарту; к (A) і k (BC) - Поправочні коефіцієнти. 
В останніх двох методах потрібне введення поправочних коефіцієнтів, які характеризують чутливість використовуваних детекторів до аналізованих речовин. Для різних типів детекторів і різних речовин коефіцієнт чутливості визначається експериментально. 
У рідинної адсорбційної хроматографії використовується також аналіз фракцій розчинів, зібраних в момент виходу речовини з колонки. Аналіз може бути проведений різними фізико-хімічними методами. 
Рідинну адсорбційну хроматографію застосовують в першу чергу для поділу органічних речовин. Цим методом вельми успішно вивчають склад нафти, вуглеводнів, ефективно розділяють - транс-і цис-ізомери, алкалоїди та ін За допомогою ВЖХ можна визначати барвники, органічні кислоти, амінокислоти, цукру, домішки пестицидів і гербіцидів, лікарських речовин та інших забруднювачів у харчових продуктах. 
3.2. Іонообмінна хроматографія 
Іонообмінна хроматографія (ІХ) є різновидом рідинної хроматографії і в апаратурному оформленні нічим не відрізняється від інших видів рідинної колонкової хроматографії. В основі іонообмінної хроматографії лежить процес обміну між іонами аналізованого розчину (ПФ) і рухливими іонами того ж знака іонообмінника (НФ). 
Як іонообмінників або іонітів зазвичай використовують синтетичні полімерні речовини, звані іонообмінними смолами. Вони складаються з матриці (R) і активних груп, що містять рухливі іони. У залежності від знаку обмінюваних іонів розрізняють катіоніти і аніоніти. Катіоніти містять кислотні групи різної сили, такі як сульфогрупи, карбоксильні, оксіфенільние. Аніоніти мають у своєму складі основні групи, наприклад аліфатичні або ароматичні аміногрупи різного ступеня заміщення (аж до четвертинних). 
Іоніти можуть перебувати в Н-формі та ОН - формі, а також у сольовий формі. В Н-формі катіоніти і ОН-формі аніоніти містять здатні до обміну іони водню та гідроксилу відповідно, у сольових формах іони водню замінені катіонами металу, аніони гідроксилу - аніонами кислот. 
Залежно від сили кислотних і основних груп у іонітах розрізняють сильнокислотного (R-SOзН) і слабокислотні (R-СООН) катіоніти; сильноосновними (RN (СНз) зон) і слабоосновние (R-NНзОН). 
Сильнокислотного і сильноосновними іоніти здатні до іонного обміну в широкому діапазоні рН. 
Процес іонного обміну протікає стехіометрічно. Наприклад: 
R-SO 3 H + Na + = RSO 3 Na + H + 
R (NНз) зон + Сl - = R (NНз) зСl + ОН - 
Це іонообмінне рівновагу характеризується константою іонного обміну: 
[H +] [RSO 3 Na] [OH -] [RN (CH 3) 3 Cl 
K H + / Na +=______________; K OH - / Cl - = _________________ 
[Na +] [RSO 3 H] [Cl -] [RN (CN 3) 3 OH] 
На підставі констант іонного обміну побудовані ряди спорідненості іонів до даного іоніту, що дозволяють передбачати можливості іонообмінних розділень. 
У залежності від спорідненості до фіксованих іонів нерухомої фази колективні іони переміщуються вздовж хроматографічної колонки з різними швидкостями; чим вище спорідненість, тим більше обсяг утримування компонента. При поділі органічних кислот і підстав важливу роль грає ступінь їхньої дисоціації. 
Для двох речовин, що мають різні константи обміні, розраховують фактор поділу або коефіцієнт розподілу, який характеризує селективність іоніти 
K A 
f a / b = ___, (3.2.1) 
K B 
  
де f a / b - фактор поділу; K A; K B - константи іонного обміну речовин А і В. Чим більше фактор поділу, тим сильніше іоніти утримує речовина А. 
Наприклад, константи іонного обміну солей заліза (III) і кобальту (II) на сильнокислотного катионит марки КУ-2 становлять 3726 і 286 відповідно. 
3726 
Тоді згідно з формулою 7.2.1 отримаємо: F Fe 3 / Co 2 + = ____= 13. 
                                                                                      286 
Таким чином, можна зробити висновок, що катионит КУ-2 більш селективен до іонів заліза (III). 
Важливою кількісною характеристикою іонітів є їх обмінна ємність. Повна обмінна ємність визначається кількістю еквівалентів іонів, обмінюваних одним грамом сухого іоніту. Чим більше обмінна ємність, тим більшу пробу можна ввести в колонку з іонітом. 
При підготовці іонітів до роботи їх переводять у відповідну форму. Так, для перекладу катіоніту в Н-форму через колонку з набряклим іонітом пропускають розчин сильної кислоти, надлишок якої відмивають водою. Потім повільно пропускають розчин суміші іонів. Кожен катіон затримується на іоніте згідно зі своєю сорбуємість. Далі пропускають відповідний елюент. Наприклад, катіони лужних металів легко елюіруются 0,1 М HCl. При цьому іони водню обмінюються на сорбовані катіони, які разом з розчином виходять з колонки у відповідності з константами іонного обміну. На виході з колонки фракції збирають в окремі судини і визначають зміст будь-яким підходящим методом. 
Іоніти застосовуються для деионизации (знесолення) води, очищення цукрових сиропів від мінеральних солей; в препаративної хімії - для концентрування розчинів; для визначення іонів заліза (III), міді і свинцю у вині, кальцію і магнію в молоці; різних металів в біологічних рідинах. Крім того, іонний обмін використовують для перекладу іонів у форму, зручну для кількісного визначення. Наприклад, кухонну сіль в розсолі можна визначити, пропустивши пробу через колонку з катионитом, і виділилася в еквівалентній кількості кислоту відтитрувати лугом: 
R-SOзН + NaCI = R - SO з Na + НСl. 
Іонообмінну хроматографію застосовують для розділення фенолів, карбонових кислот, аміноцукрів, пуринових, піримідинових та інших підстав. Часто іоніти використовують для попереднього розділення складних сумішей на менш складні. На іонному обміні засновано отримання іонітні молока для дитячого харчування. Іонний обмін використовують для очищення натуральних соків від іонів важких металів. Іонообмінні смоли застосовують для отримання іонообмінних мембран. 

3.3. Тонкошарова хроматографія 
  
Тонкошарова хроматографія (ТШХ) є одним з найбільш простих і ефективних експрес-методів розділення і аналізу речовин у харчових продуктах, біологічних рідинах і інших об'єктах, що не вимагають складного устаткування. У той же час метод має високу вибірковість і чутливістю (низькою межею виявлення). Цим методом можна визначити 10-20 мкг речовини з точністю до 5-7%. 
У залежності від природи НФ тонкошарова хроматографія може бути адсорбційної і розподільної. Найбільш широко застосовується в ТШХ перший варіант поділу. 
Нерухома тверда фаза (оксид алюмінію, силікагель і ін) тонким шаром наноситься на скляну, металеву (алюмінієва фольга) або пластмасову пластинку, закріплюється шар за допомогою крохмалю або гіпсу (іноді використовують платівки з незакріпленим шаром). Для хроматографування можуть використовуватися готові пластинки, що випускаються промисловістю, розміром 5х15 або 20х20 см. 
На відстані 2 см від краю пластинки на стартову лінію за допомогою мікропіпетки або микрошприца наносять проби аналізованого розчину (діаметр плям 3-5 мм). Після випаровування розчинника край платівки поміщають в скляну камеру, на дно якої налитий розчинник (ПФ) в кількості, достатній для утворення шару глибиною 0,5 см. Камеру закривають кришкою. 
Вибір розчинника (ПФ) залежить від природи сорбенту і властивостей аналізованих сполук. Наприклад, поділ хлорорганічних пестицидів на платівці з силікагелем проводять у середовищі гексану. Часто застосовують суміші розчинників з двох або трьох компонентів. Так, при хроматографування амінокислот використовують суміш Н-бутанолу з оцтовою кислотою і водою, при аналізі неорганічних іонів - водні буферні розчини, що створюють постійне значення рН. 
При хроматографування розчинник рухається знизу вгору (висхідний варіант) вздовж шару сорбенту і з різною швидкістю переносить компоненти суміші, що призводить до їх просторового розділення. Після закінчення хроматографічного процесу платівку виймають з камери, відзначають лінію фронту розчинника (зазвичай близько 10 см) і висушують. 
Якщо компоненти суміші пофарбовані, то вони чітко видно на пластині після поділу. Нефарбовані з'єднання виявляють різними способами. Якщо пластину помістити в камеру з парами йоду, то чітко проявляються коричневі плями для органічних сполук з неграничними зв'язками. Хроматограму можна проявити, обприскуючи її будь-яким реагентом, що дає з компонентами проби забарвлені сполуки. До складу нанесеного шару в готові пластини часто вводять люмінофор. При опроміненні такої пластини ультрафіолетовим (УФ) світлом вона флуоресціює, а розділені компоненти проби видно у вигляді темних плям. Речовини, що мають власну флуоресценцію, також виявляють в УФ - світлі (наприклад, пестициди). 
Ідентифікацію речовин на хроматограмі здійснюють за характером забарвлення плям, параметру утримування R f і за допомогою стандартних речовин (свідків). 
Величина R f розраховується з експериментальних даних за рівнянням 
l 
R f = __, (3.3.1) 
L 
де l - відстань від стартової лінії до центру плями, L - відстань, пройдена за цей же час розчинником (рис. 3.3.1). 
Рис. 3.3.1. Хроматограмма двокомпонентної суміші 
а - а: лінія старту, в - у: лінія фронту розчинника 
При стандартних умовах величина R f є постійною величиною, характерною для даного з'єднання. Але практика показує, наскільки важко створювати сталість всіх факторів, від яких залежить відтворюваність значень R f. На величину R f впливає якість і активність сорбенту, його вологість, товщина шару, якість розчинників та інші фактори, не завжди піддаються достатньому контролю. 
Рис. 3.3.2. Хроматограмма жиру. I - по лімерізованние і сільнополярние жири; II - фосфоліпіди, III - тригліцериди 1 - яловиче м'ясо, 2 - свинина, 3 - свинина з 29% печінки, 4 - свинина з 4% печінки, 5 - свинина з 50% печінки ; 6 - свиняча печінка 
Тому поряд з величиною R f ідентифікацію проводять по "свідка". Стандартне речовина (свідок), наявність якого припускають в аналізованій суміші, наносять на лінію стандарту поруч з досліджуваної пробій. Таким чином, стандартне речовина хроматографіруется в тих же умовах. Після хроматографування і детекції плям порівнюють величини R f визначається речовини і "свідка". 
Якісний аналіз після поділу компонентів суміші методом ТШХ часто використовують для визначення складу харчових продуктів. Так, на рис. 3.3.2 представлена ​​хроматограмма жиру, виділеного з м'ясного фаршу різного складу. Хроматографування проводили на пластинках з силікагелем в системі гександіетіловий ефір (у співвідношенні 3:1), плями детектувала 10% розчином фосфорно-молібденової кислоти, ідентифікували за блакитному кольору зон на жовтому фоні платівки. Як видно з хроматограми, за даних умов відбулося розділення фосфоліпідів і тригліцеридів. За характерному складу компонентів м'яса та печінки можна зробити висновок про натуральність м'ясного фаршу в пробах 1-2, і добавках до нього печінки в пробах 3-5. 
Кількісне визначення в ТХС може бути проведене безпосередньо на платівці, йди після видалення речовин з платівки. При безпосередньому визначенні на платівці вимірюють тим чи іншим способом площа плями (наприклад, за допомогою міліметрової кальки) і за заздалегідь побудованому градуювальним графіком знаходять кількість речовини. Залежність між масою речовини q і площею S на хроматограмі носить нелінійний характер і є логарифмічною: 
S = a lg q + в, (3.3.2) 
де а і в емпіричні константи. Ця залежність лінійна для кількостей речовини від 1 до 80-100 мкг. 
Рис. 3.3.3. Залежність площі плям на хроматограмі від кількості речовини: а - хроматограмма, б - калібрувальний графік 
Для побудови градуювального графіка на пластинку наносять розчини, що містять різні кількості стандартного речовини, хроматографіруют, виявляють зони і вимірюють їх площі (рис. 3.3.3). 
Більш точний денситометрических метод визначення речовин на хроматограмі (помилка - 1-2%). У методі денситометрії проводять вимірювання оптичного поглинання виявленої хроматограми скануючим променем у минаючому чи відбитому світлі на спеціальних приладах-денситометрах (ріс.3.3.4.). 
Рис. 3.3.4. Схема денситометра. 1 - протяжний механізм; 2 - джерело світла; 3 - хроматограмма, 4 - фотоелектричний перетворювач, 5 - підсилювач, 6 - самописець. 
На денситограмме отримують піки, площа яких пропорційна вмісту речовини в плямі. Побудувавши за допомогою стандартів калібрувальний графік, вимірюють площу піку компонента і за графіком визначають його масу в пробі. Отримують розвиток також спектрофотоденситометрическое і флуоріметріческое визначення речовин на хроматограмі. 
У першому випадку використовують спеціальні спектрофотоденсітометри, що вимірюють поглинання речовини в монохроматичному світлі, у другому вимірюють флюоресценцію плями при опроміненні хроматограми УФ світлом. Широке поширення одержав спосіб екстрагування компонентів із зон відповідним розчинником. При застосуванні цього способу на хроматограму наносять стандартний розчин і розчин проби. Після отримання хроматограми виробляють її обробку, детектіруя зону стандарту, вирізують частину хроматограми із зоною компонента проби і проводять його екстрагування відповідним розчинником. Отриманий розчин аналізують інструментальним методом, що має високу чутливість. Найчастіше застосовують спектрофотометричні та фотоколориметричні методи. Якщо речовина не має кольору або не володіє поглинанням в УФ-області, з екстрактом проводять фотометричну реакцію, яка дозволяє отримати інтенсивно поглинає похідне речовини. 
Тонкошарова хроматографія знаходить застосування при дослідженні деяких видів харчових продуктів на безпеку. Наприклад, для визначення токсинів (афлатоксинів, мікотоксинів, патуліну та ін) в арахісі, у зернових, овочах, фруктах, напоях; для визначення пестицидів (ДДТ та ін) в рослинних і тваринних продуктах, визначення гістаміну як показника псування риби. Крім того, ТШХ часто поєднують з газовою хроматографією, електрофорезом та іншими методами. 
3.4. Хроматографія на папері 
По механізму поділу розрізняють розподільну, адсорбційну, осадову та інші види паперової хроматографії (БХ). У розподільній рідина-рідинної хроматографії папір, приготовлена ​​зі спеціальних сортів бавовни, виконує роль носія нерухомої рідкої фази (НФ), в якості якої часто виступає вода, адсорбована парами паперу. У такому випадку гідрофільна папір використовується для нормально-фазової хроматографії. 
Розчинниками (ПФ) є спирти (метанол, етанол, н-пропанол, бутанол), прості ефіри (етиловий, метиловий), кетони (ацетон, ацетил-ацетон), ефіри органічних кислот (Метилацетат, етилацетат), піридин, хлороформ. Частіше використовуються суміші розчинників. Так, для поділу неорганічних неполярних речовин вживають системи: 
- Ацетон: НCl: Н 2 О (в різних співвідношеннях); 
- Н-бутанол, насичений НСl (різної концентрації); 
- Н-бутанол: 0,1 М НNОз - ацетилацетон. 
Для розділення деяких органічних речовин використовують метод звернених фаз. У цьому методі для надання папері гідрофобного характеру її импрегнирующими (просочують) нафталіном, парафіном, розчином каучуку, силіконом і ін Такий папір є носієм для неполярних розчинників як НФ. Як ПФ застосовують суміші кислот з нижчими спиртами. 
Обращеннофазовая паперова хроматографія використовується, наприклад, для розділення й ідентифікації полінасичених жирних кислот при вивченні складу ліпідів, виділених з тварин тканин. Папір просочують 5% розчином силікону, як ПФ використовують 85% розчин оцтової кислоти.