Ріс.3.4.1. Види паперової хроматографії 
Поділ речовин в розподільній БХ здійснюється завдяки розбіжності у швидкостях руху компонентів при багаторазовому повторенні актів екстракції та сорбції. Швидкість переміщення компонентів залежить від їх коефіцієнтів розподілу (як і в методі екстракції). 
По напрямку руху елюента (ПФ) розрізняють висхідну, спадну і радіальну (кругову) хроматографію. 
Якщо елюент рухається по паперу вгору, метод називають висхідною (а) паперової хроматографією; при його русі зверху вниз - низхідною (б) паперової хроматографією. Дуже швидко можна здійснити хроматографічний аналіз методом радіальної (в) паперової хроматографії, в якому використовується паперове коло (г) з гнотом, опущеним у елюент. (Рис. 3.4.1) 
Іноді при складному складі проби не вдається розділити її компоненти з допомогою одного розчинника. Тоді застосовують двовимірну хроматографію. У кут квадратного аркуша хроматографічного паперу наносять хроматографічного паперу наносять розчин проби і хроматографіруют спочатку в одному елюент, потім, повернувши хроматограму на 90, - в іншому. Перший елюент виробляє попереднє розділення компонентів проби, другий остаточне (ріс.3.4.2). 
Ріс.3.4.2. Двомірна хроматографія 
Для проведення хроматографії на папері використовують скляні герметизовані камери. Всередині камери у верхній (спадний варіант) або нижньої її частини (висхідний варіант) поміщають посудину для рухомої фази (човник). 
Радіальну хроматографію можна здійснити в чашці Петрі. Детекцию зон, ідентифікацію та кількісне визначення в БХ проводять також, як і в методі тонкошарової хроматографії. 
Методом розподільчої рідинної паперової хроматографії успішно аналізують суміші катіонів у неорганічний якісному аналізі, суміші амінокислот і інших органічних кислот, пептидів, пестицидів, фенолів, барвників, синтетичних поверхнево-активних речовин. 
3.5. Гельпронікающая (молекулярно-ситова) хроматографія 
Гельпронікающая хроматографія (ЦПХ) являє собою метод поділу молекул, заснований на розходженні з розмірів. 
Як НФ в ЦПХ використовують частки, що мають певні розміри пор. Це різного роду гелі (м'які, напівтверді і тверді). Як ПФ служать водні або органічні елюент. Принцип поділу молекул в ЦПХ полягає в тому, що молекули аналізованих речовин розподілені між нерухомим розчинником в порах сорбенту і розчинником, що протікає через шар НФ. Молекули, які мають розміри, що дозволяють їм проникати в пори сорбенту при русі вздовж колонки, частину часу втрачають на перебування в порах. Молекули, що мають розміри, що перевищують розміри пір, не проникають в сорбент і вимиваються з колонки зі швидкістю руху елюента. Молекули, які проникають в пори всіх розмірів, рухаються найбільш повільно. Зниження швидкості руху речовин вздовж колонки тим більше, ніж в більше число пір здатні дифундувати розподіляються частки. 
Таким чином, за допомогою ЦПХ можна розділити суміші речовин залежно від розмірів їх молекул. Вихід речовин з колонки відбувається у порядку зменшення їх молекулярної маси. Так можна розділити поліпептиди, білки та інші макромолекули. 
Гельпронікающая хроматографія на колонці використовується для очищення пестицидів, а також жиророзчинних вітамінів перед їх визначенням методом ВЖХ. 
Електрофорез 
Метод аналізу, що базується на здатності заряджених частинок до пересування в зовнішньому електричному полі називають електрофорезом (від "електро" і грецького phoresis - перенесення). 
Електроліз відноситься до методів розділення без перетворення речовин, на основі заряду частинок. За технікою виконання метод аналогічний хроматографії, тому і розглядається в цьому розділі. 
Рис 3.5.1. Схема приладу для електрофорезу. 
Нерідко під електрофорезом розуміють переміщення колоїдних частинок або макромолекул, на відміну від іовофореза - переміщення неорганічних іонів малого розміру. 
Пересування частинок при електрофорезі залежить від ряду факторів, основними з яких є: напруженість електричного поля; величина електричного заряду; швидкість і розмір частки; в'язкість, рН і температура середовища, а також тривалість електрофорезу. 
Електрофорез можна проводити як у вільному розчині (фронтальний електрофорез), так і на носіях (зональний електрофорез). Останній варіант переважно, оскільки носії сприяють стабілізації електрофоретичних зон. В якості носіїв використовують: фільтрувальний папір, силікагель, крохмаль, оксид алюмінію, полівінілхлорид, агарових і поліакріламідний гелі та ін 
Електрофоретичне поділ здійснюють на папері, в тонкому шарі сорбенту, колонці чи в блоці (який часто формують із суспензії крохмалю у відповідному електроліті). 
Апаратура для електрофорезу виконується за єдиною схемою: джерело струму, камера для електрофорезу, два електроди, що з'єднують камеру з джерелом струму і пристосування для збору та ідентифікації розділених речовин (останній блок у деяких випадках відсутня). Для електрофорезу використовують як готові набори апаратури (універсальний прилад для імуноелектрофорез та електрофорезу білків на папері і крохмалі, набір для електрофор за в поліакриламідному гелі угорської фірми Реана), так і набори, що складаються експериментатором з окремих приладів. 
На рис. 3.5.1 представлена ​​схема приладу для електрофорезу на папері. Електрофоретична камера складається з двох кювет, в які поміщають графітові електроди і розчин провідної рідини (буферний розчин). Вище кювет знаходиться підставка для носія паперу. Суміш речовин, що підлягають розподілу, наносять на просочену проводить рідиною папір. Папір підсушують, поміщають на підставку, кінці занурюють у кювети, потім камеру щільно закривають кришкою. Після просочування паперу проводить рідиною підключають електричний струм. Після закінчення електрофорезу папір підсушують. Якісну і кількісну оцінку здійснюють, застосовуючи методи, використовувані в паперовій хроматографії, наприклад, прояв білків за допомогою барвників, кількісну оцінку - методом денситометрії. 
Важливою сферою застосування електрофорезу є аналіз білків сироватки крові, амінокислот гідролізатів білків, нуклеїнових кислот і т.п. У кислотному буферному розчині амінокислота знаходиться у вигляді катіона NHз + ...... COOH, який буде переміщатися до катода, в той час як у лужному буфері амінокислота перетворюється на аніон NH 2 .... COO -, і буде рухатися до анода . У ізоелектричної точці амінокислота знаходиться в розчині у вигляді біполярного іона NH 3 + ...... COO - і не буде пересуватися в електричному полі. 
Рис. 3.5.2. Електрофореграма (а) і схеми (б) білкових фракцій. 
  A - білкові фракції сирів: 1, 17 - російського, 2, 16 - волзького, 3, 15 - "Орбіта", 4, 14 - ковбасного, 5, 13 - голландського, 6, 12 - пошехонський, 7, 11 - "сирного "казеїну після осадження при pH 4, 6, 8, 10 - молочної сироватки, 9 - казеїну по Гаммерстену, 18 -" міського ". 
Б - білкові фракції сиру (I), сирного казеїну (II) 
З огляду на те, що окремі білки і амінокислоти мають різні ізоелектрична точки, при певному значенні рН вони будуть рухатися з різною швидкістю. Підбираючи відповідні буферні розчини для встановлення певної швидкості руху і розчинності речовин, можна використовувати електрофорез для їх розділення. Метод дозволяє розділяти речовини, відмінність в ізоелектричній точці яких складає до 0,02 одиниць рН. Градієнт рН в 0,02 одиниці часто досягають додатком амфоліти, що представляють собою готову суміш аліфатичних поліамінаполікарбонових кислот. 
Електрофоретичне поділ білків широко використовується для оцінки якості м'яса і м'ясних продуктів, для диференціювання виду м'яса і риби. Метод також застосовується для виявлення нем'ясних добавок (білків молока, сої, яєць) в м'ясних продуктах. За допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі можна охарактеризувати зміна білків у процесі дозрівання сирів (ріс.3.5.2). 
В даний час використовують високоефективний капілярний електрофорез, наприклад, для аналізу вітамінів в дієтичних продуктах (жиророзчинні А, Е, К, Д; водорозчинних - B 1, B 2, B 6, B 12, С, нікотинаміду); і для визначення аніонів ( сульфат - хлорид-, йодид-) у молочних продуктах. 
3.6. Газова хроматографія 
У газовій хроматографії (ГХ) як ПФ використовують інертний газ (азот, гелій, водень), званий газом-носієм. Пробу подають у вигляді пари, нерухомою фазою служить або тверда речовина - сорбент (газо-адсорбційна хроматографія) або висококиплячих рідина, нанесена тонким шаром на твердий носій (газорідинна хроматографія). Розглянемо варіант газорідинної хроматографії (ГЖХ). В якості носія використовують кизельгур (діатоміт) - різновид гідратованого силікагелю, часто його обробляють реагентами, які переводять групи Si-OH в групи Si-О-Si (CH 3) 3, що підвищує інертність носія по відношенню до розчинників. Такими є, наприклад, носії "хромосорб W" і "газохромQ". Крім того, використовують скляні мікрошарікі, тефлон і інші матеріали. 
Нерухому рідку фазу наносять на твердий носій. Ефективність розділення в газорідинної хроматографії залежить головним чином від правильності вибору рідкої фази. При цьому корисним виявилося старе правило: "подібне розчиняється в подібному". Відповідно до цього правила для розділення суміші двох речовин вибирають рідку фазу, близьку за хімічною природою одному з компонентів. Підготовлений носій поміщають в спіральні колонки, що мають діаметр 2 - 6 мм і довжину до 20 м (набивні колонки). З 1957 року стали застосовувати запропоновані Голео капілярні колонки, що мають діаметр 0,2 - 0,3 мм і довжину в кілька десятків метрів. У випадку капілярних колонок рідка фаза наноситься безпосередньо на стінку цього капіляра, яка виконує роль носія. Застосування капілярних колонок сприяє підвищенню чутливості та ефективності поділу багатокомпонентних сумішей. 
Ріс.3.6.1. Блок-схема газового хроматографа. 
Аналіз методом ГХ виконують на газовому хроматографі, принципова схема якого наведена на рис. 3.6.1. 
Газ - носій з балона 1 з постійною швидкістю пропускають через хроматографічну систему. Пробу вводять микрошприца в дозатор 2, який нагрітий до температури, необхідної для повного випаровування хроматографіруемого речовини. Пари аналізованої суміші захоплюються потоком газу - носія і надходять у хроматографічну колонку, температура якої підтримується на необхідному для проведення аналізу рівні (вона може бути незмінною, або за необхідність змінюватися в заданому режимі). У колонці аналізована суміш ділиться на компоненти, які по черзі надходять в детектор. Сигнал детектора фіксується реєстратором (у вигляді піків) і обробляється обчислювальним інтегратором. 
У ГХ використовують детектори, які перетворять в електричний сигнал зміни фізичних або фізико-хімічних властивостей газового потоку, що виходить з колонки, в порівнянні з чистим газом - носієм. Існує безліч детекторів, проте широке застосування знаходять тільки ті з них, які мають високу чутливість і універсальністю. До таких належать: катарометра (детектор по теплопровідності); полум'яно-іонізаційний детектор (ПІД), в якому водневе полум'я служить джерелом іонізації органічної сполуки; детектор електронного захоплення (ЕЗД); термоіонні детектор (ТІД), який володіє високою селективністю до органічних речовин, містить фосфор, азот і сірку. Інтерес до цього детектора помітно зріс у зв'язку із заміною хлорвмісних пестицидів на фосфорсодержащие отрутохімікати, що використовуються в сільському господарстві і попадають потім у харчові продукти. 
Катарометра дозволяє визначити концентрації речовин в межах 0,1 - 0,01%, ПІД - 10 -3 - 10 -5% "; ЕЗД - 10 -6 - 10 -10%. Сучасні детектори дозволяють визначати навіть пікограмів (10 -12 г) речовини в пробі. 
Якісний і кількісний аналіз в методі ГХ проводять так само, як і в ВЖХ. 
Газорідинна хроматографія знаходить широке застосування для розділення, ідентифікації та кількісного визначення складних багатокомпонентних систем, таких як нафта, біологічні рідини, харчові продукти, парфумерно-косметичні вироби та багато інших. Метод відрізняється високою чутливістю, експресність; для аналізу не потрібно великої кількості досліджуваного зразка. 
Серед різноманітних хроматографічних методів газова і високоефективна рідинна хроматографія є найбільш перспективними для вирішення складних завдань у практиці харчового аналізу. 
Так, до числа завдань, які можуть бути дозволені у харчовому аналізі за допомогою цих методів, входять: 
- Визначення хімічної природи речовин, які обумовлюють характерний аромат свіжих продуктів; 
- Контроль за станом продуктів у процесі обробки та зберігання; 
- Об'єктивна оцінка показників, що характеризують якість вихідної сировини і готових виробів з нього; 
- Встановлення та усунення причин, що викликають небажані зміни продуктів у процесі їх виготовлення; 
- Встановлення факту фальсифікації продукту та інші. 
Ріс.3.6.2. Хроматограмма афлотоксинів в молоці. Реєстрація за допомогою флуометріческого детектора (збудлива довжина хвилі 365 нм, збуджена 455 нм). 
Методами ГХ і ВЖХ ідентифікують і визначають леткі речовини, що беруть участь у формуванні смаку і аромату багатьох харчових продуктів або відповідають за їх псування. Наприклад, визначають леткі жирні кислоти, характерні для якісного м'яса; або кислоти, які утворюються при зміні нормального процесу бродіння квашеної капусти і обумовлюють сторонні відтінки її запаху. Методи використовуються для визначення нікотину, нітрозаміни (в рибі і копченостях); харчових добавок (барвники, консерванти, антиокислювачі); забруднювачів навколишнього середовища (пестициди, афлатоксини, залишки лікарських препаратів, вітаміни) та ін На рис. 3.6.2 представлена ​​хроматограмма поділу афлатоксинов в молоці. 
Дуже цінними є методи ГХ і ВЖХ у встановленні фактів фальсифікації споживчих товарів. Так, жовтий барвник у макаронних виробах може створити враження про високу вартість продукту. Наявність такого барвника можна підтвердити методом ВЖХ. Визначення антоціанів та глікозидів, що відповідають за колір вина, дозволяє виявити натуральність вина. Підробки коньяку також можна розпізнати за допомогою ГХ. 
Методом ВЖХ ідентифікують і визначають небілковий азот, наприклад, сечовину, яку додають при фальсифікації білкових продуктів з метою збільшення азотистих речовин. Виявлення амінокислоти оксипроліну, присутньої, головним чином, в білках сполучної тканини, тобто в дешевій сировині, дозволяє виявити факт заміни їм повноцінного білка м'яса. Жири, що визначаються за трігліцерідному складу методом ГХ, можуть дати інформацію про кількість жиру і добавках стороннього жиру. За визначенням жирно-кислотного складу можна зробити висновок про заміну какао-масла гідрожіром в шоколаді і т.п. 
Слід зазначити, що в даний час деякі види хроматографії використовують не як самостійні методи аналізу, а як методи попереднього випробування, або як методи підготовки проби до подальшого визначення іншими методами, в тому числі хроматографічними. 
Так, при визначенні амінокислот в гідролізаті білків м'яса або крові методом БХ, проводять попереднє очищення гідролізату на колонках з іонітами. Аналогічно роблять при визначенні летючих підстав і вільних жирних кислот в м'ясі та рибі. 
Методом ТШХ встановлюють наявність в досліджуваному зразку хлорорганічних пестицидів, кількісне визначення яких потім проводять методом ГЖХ. 
Рис. 3.6.3. Поєднання газової хроматографії з іншими принципами аналізу і включеної послідовно ЕОМ. 
Особливо ефективним виявилося застосування незалежної аналітичної ідентифікації та визначення продуктів хроматографічного розділення при поєднанні ГХ і ВЖХ з іншими методами дослідження: інфрачервоної спектроскопії та мас-спектрометрією. Методом мас-спектрометрії можна проводити безперервний аналіз компонентів суміші, причому для невеликих кількостей речовин. Такий комбінований (гібридний) метод отримав назву хромато-мас-спектрометрії. Наприклад, визначення пестицидів, залишків лікарських речовин (пеніцилінів, сульфаніламідів тощо) проводять, використовуючи комплекс: ГХ (або ВЖХ) - мас-спектрометрія. Можливо поєднання хроматографії з методами ядерного магнітного резонансу, полум'яної (фотометрії, абсорбційної спектрометрії та ін.) 
На ріс.3.6.3 представлена ​​приблизна схема поєднання газової хроматографії з іншими методами аналізу і ЕОМ. 
Висновок 
  
Застосування хроматографії поряд з іншими фізико-хімічними методами, а також їх взаємне поєднання, є тенденцією в розробці методик дослідження якості споживчих товарів. 
Рис. 3.6.4. Хроматограмма градуювальної суміші, отримана на хроматографі, оснащеному капілярної колонкою HP-FFAP (США) 
1 оцтовий альдегід, 2 метиловий спирт оцтової кислоти, 3 етиловий ефір оцтової кислоти, 4 метиловий спирт, 5 етиловий спирт, 6 пропанол-1, 7 ізобутіловий спирт, 8 - 6 бутанол-1, 9 ізоаміловий спирт. 
Відбувається перегляд державних стандартів. Так, у 1997-1998 р.р. введені нові стандарти з дослідження якості води питної (ГОСТ Р51209-98), на вміст хлорорганічних пестицидів і етилового спирту та горілки (ГОСТ 30536-97), які регламентують визначення вмісту токсичних мікродомішок методами газорідинної хроматографії. На рис. 3.6.4 представлена ​​хроматограмма токсичних мікродомішок горілки і етилового спирту, з якої видно, що методом ГЖХ з використанням капілярної колонки можливо роздільне визначення всіх компонентів (на відміну від методик попереднього ГОСТ). 
Методи хроматографії володіють великою аналітичної ємністю, і, як вже було зазначено вище, знаходять саме широке застосування. 
Література: 
  
  
1. Дорохова О.М., Прохорова Г.В. Аналітична хімія. Фізико-хімічні методи аналізу. - М.: Вища школа, 1991.-256 с. 
2. Курко В.І. Хромат